2 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

Размножение комнатных растений с помощью микротехнологий

Раздел «Культуры растительных клеток»

Микроклональное размножение и оздоровление растений

Методы микроклонального размножения

Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

1. Активация пазушных меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :

а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

б) индукция соматического эмбриогенеза;

в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений — активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования (рис. 18).

Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.

Рис. 18. Схема размножения растений методом активации уже существующих меристем (по А. Р. Родину, Е. А. Калашниковой, 1993): 1 – путем удаления верхушечной меристемы: 2 – добавлением цитокининов в среду (б/г – среда без гормонов, Ц – цитокинин, А – ауксин)

Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами. Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro (рис. 19), а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений (рис. 20).

Рис. 19. Образование корней побегами розы при добавлении в питательную среду 2 мг/л 2,4-Д

Рис. 20. Адаптация пробирочных роз к почвенным условиям

В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, а также для размножения культур промышленного цветоводства (например, гвоздики, рис. 21), тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений. Для некоторых культур, таких как картофель, технология клонального размножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития существующих меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100000 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней — ценного безвирусного семенного материала.

Рис. 21. Пробирочная гвоздика

Второй метод — индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения. Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК. Таким способом были размножены многие представители семейства лилейных, томаты, древесные растения (из зрелых и незрелых зародышей).

Достаточно хорошо разработана технология клонального размножения земляники, основанная на культивировании апикальных меристем. Меристематические верхушки изолируют из молодых, свободных от вирусных болезней растений, и выращивают на питательной среде МС, содержащей БАП в концентрации 0,1 — 0,5 мг/л. Через 3 — 4 недели культивирования меристема развивается в проросток, в основании которого формируются адвентивные почки, быстро растущие и дающие начало новым почкам. В течение 6-8 недель образуется конгломерат почек, связанных между собой соединительной тканью и находящихся на разной стадии развития. Появляются листья на коротких черешках, в нижней части которых формируются новые адвентивные почки. Эти почки разделяют и пересаживают на свежую питательную среду. На среде без регуляторов роста за 4 — 5 недель формируются нормальные растения с корнями и листьями. От одного материнского растения таким образом можно получить несколько миллионов растений-регенерантов в год.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему виду напоминают зиготические зародыши (рис. 22). Этот метод получил название соматического эмбриогенеза. В отличие от развития in vivo, соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию развития в проросток. На рисунке 3 показан конечный результат развития – растение пшеницы.

Рис. 22. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани

Наиболее впечатляющим применением метода соматического эмбриогенеза стало размножение гвинейской масличной пальмы (Elaeis guineensis), масло которой широко используется при производстве маргарина и пищевого масла. Масличная пальма в природе не образует побегов и боковых ростков, что затрудняет ее вегетативное размножение. Культивирование черенков in vitro также невозможно. Было решено получить скопления клеток недифференцированной ткани (каллусы) путем дедифференцировки специфических тканей, а затем культивировать их до регенерации целых проростков. В первой культуральной среде каллусы из фрагментов листьев развивались в течение 90 дней, при переносе во вторую и третью культуральные среды превращались в «эмбриоиды». Эмбриоиды размножались самопроизвольно, в течение месяца число эмбриоидов возрастало втрое, а за год из 10 эмбрионов можно было получить потомство численностью 500000 растений.

Формирование эмбриоидов в культуре тканей осуществляется в несколько этапов. Сначала происходит дифференциация клеток под влиянием ауксинов, добавленных в питательную среду (2,4-Д) и превращение их в эмбриональные. Получить эмбриоиды из этих клеток можно уменьшая концентрацию ауксинов или исключая их из питательной среды. Соматические зародыши представляют собой полностью сформированные зародыши, из которых путем соответствующего капсулирования можно получить искусственные семена.

Четвертый метод клонального микроразмножения — дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани (рис. 23).

Рис. 23. Дифференциация придаточных почек в каллусной ткани

Практически он мало используется с целью получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при частом пассировании каллусной ткани может изменяться плоидность регенерируемых растений, наблюдаются структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетическими изменениями отмечаются и морфологические: низкорослость, неправильное жилкование листьев, образование укороченных междоузлий, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. В то же время, некоторые недостатки этого метода в селекционной работе оборачиваются преимуществами.

Рис. 24. Формирование побегов каллусной тканью пшеницы

Кроме того, в некоторых случаях он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. Через каллусную культуру успешно размножаются сахарная свекла, злаковые (рис. 24), представители рода Brassica, подсолнечник и другие культуры.

Клональное микроразмножение растений

В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Эти способы имеют свои преимущества и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:
1) не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);

2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10-15 лет;

3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (существует возможность накопления и передачи инфекции);

4) операции при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок отличаются трудоемкостью и сложностью;

5) разработанные технологии не эффективны для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Для обозначения растений, полученных бесполым размножением, в 1903 г. Уэббер из Министерства сельского хозяйства США ввел термин клон от греч. clon — черенок (побег), пригодный для размножения.

Клон — популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки.
Клональное микроразмножение — получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному.

Этапы и методы клонального микроразмножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа: 1 — выбор растения-донора (донор — растение, часть которого вводится в культуру), изолирование эксплантов (эксплант — ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и поддержания жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2 — собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов (микропобегов); 3 — укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (2-10 С); 4 — выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле (рис. 4.1).

Существует много методов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, способствовало созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения.

В литературе предложены следующие методы микроразмножения растений: активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля); индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; индукция соматического эмбриогенеза; дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Первый метод, используемый при клональном микроразмножении растений, — это активация развития уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями:

1. Удаление верхушечной меристемы стебля (снятие апикального доминирования) и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде. Апикальное доминирование — подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной почки.

2. Добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2-iр) и зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта (инокулюм (трансплант) — часть суспензионной или каллусной культуры, переносимой в свежую питательную среду) и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков (рис. 4.2).

Читать еще:  Удобрение для комнатных растений в домашних условиях

В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур, таких как технические (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощные (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.).

Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких как картофель, технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную основу (рис. 4.3). Применение метода активации развития существующих в растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 105 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней — ценного безвирусного семенного материала.
Формирование растения капусты из пазушной почки показано на рис 4.4.

Второй метод — это индукция возникновения адвентивных почек непосредственно на тканях экспланта. (Адвентивный — добавочный побег. Развитие растений из необычных точек происхождения, например, почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот.

Этот термин также может быть использован для описания агентов, загрязняющих клеточные культуры). Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения.

Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1. В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют в -индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или а-нафтилуксусную кислоту (НУК).

Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи) — из сегментов гипокотиля, котиледона, листьев; лук, чеснок — из верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томаты — из апикальных или пазушных меристем; салат цикорный — из сегментов листовых пластинок; петуния — из сегментов корней; глоксиния, сенполия, стрептокарпус, эшинапсус — из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений — из изолированных зрелых и незрелых зародышей.

Несомненный интерес вызывает вопрос, связанный с происхождением адвентивных почек, в частности, какие клеточные слои участвуют в дифференциации меристем. Единого мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран Тан Ван в своих работах с тканями табака установила, что именно эпидермис является наиболее активной тканью, способной образовывать почки, каллус или корни в зависимости от гормонального баланса питательной среды.

Цитологические исследования, проведенные на сегментах базальной части донца луковиц тюльпанов и нарциссов, показали, что адвентивные побеги формируются из поверхностных слоев меристематических клеток, прилегающих к донцу, а для растений глоксинии, сенполии и стрептокарпуса процесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в субэпидермальных клеточных слоях листовых пластинок.

Единого мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей, работающих с древесными растениями. Так, Арнольд и Эрихсон, Джонсон и Борнмап считают, что образование почек на изолированной хвое ели обыкновенной под действием БАП и 2ip происходит в эпидермальном слое культивируемого экспланта, по мнению Чин и Ченга, для псевдотсуги — в субэпидермальных слоях; а Вилалобос и другие утверждают, что при культивировании семядолей сосны замечательной на среде, содержащей один цитокинин, этот процесс происходит одновременно в эпидермальном и субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было отмечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпидермальном слоях семядолей зародыша. Этот процесс для сосны не зависит от применяемых цитокининов.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматический эмбриогенез (рис. 4.5).

Основное отличие образования зародышей in vitro и in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят три стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедо-видную и в конечном счете имеют тенденцию к развитию в проросток.

Это явление впервые было отмечено в культуре клеток моркови еще в середине 50-х гг., а в настоящее время используется для размножения большинства растений из семейства Orchidaceae и Rutaceae, а также для некоторых представителей злаковых (пшеница, ячмень), люцерны, редиса, винограда и некоторых видов древесных пород (осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная).

Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа. На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за счет добавления в питательную среду ауксинов, как правило, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриональные. Для формирования эмбриоидов необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью его исключать из состава питательной среды.

Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем последний способ менее пригоден при клональном микроразмножении, так как посадочный материал, полученный таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Как правило, соматический эмбриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемкой операцией.

Однако этот метод размножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального микроразмножения, не требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений, потому что соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные семена.

Четвертый метод клонального микроразмножения — дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Каллус — неорганизованная, пролиферирующая масса дифференцированных растительных клеток. Дедифференциация — переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации. Практически он мало используется в целях получения посадочного материала in vitro.

Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду часто наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками.

Наряду с генетическими изменениями наблюдаются изменения растений и по морфологии: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоузлий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. Причем длительное культивирование каллусных клеток усугубляет эти изменения, поэтому период неорганизованного роста при микроразмножении должен быть сведен к минимуму.

Однако несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет свои положительные стороны и преимущества.

Во-первых, он является эффективным и экономически выгодным, так как в процессе размножения из каждой индивидуальной каллусной клетки при определенных благоприятных условиях культивирования может сформироваться адвентивная почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. В-третьих, представляет большой интерес для селекционеров, так как растения, полученные данным методом, отличаются генетически и морфологически друг от друга. Это дает возможность селекционерам проводить отбор растений по хозяйственно важным признакам и оценивать их поведение в полевых условиях.

Этот метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариабельность между растениями-регенерантами не превышает уровня естественной изменчивости.

К таким растениям можно отнести амариллис, эписции, драцены, томаты, спаржу, некоторые древесные породы и другие культуры. Через каллусную культуру были размножены: сахарная свекла, некоторые представители рода Бразика, кукуруза, рис, пшеница и другие злаковые, подсолнечник, лен. Разработаны условия, способствующие регенерации растений из каллуса огурца, картофеля, томатов.

В целом методы клонального микроразмножения, несомненно, имеют ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
— получение генетически однородного посадочного материала;
— освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
— высокий коэффициент размножения (10 5-10 6 — для травянистых, цветочных растений, 10 4-10 5 — для кустарниковых и древесных, 104 — для хвойных);
— сокращение продолжительности селекционного процесса;
— ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
— размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
— возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;
— возможность автоматизации процесса выращивания.

Диев А.Б. Принципы микроклонального размножения. Адаптация меристемных растений.

Лекция в МОИП 4 марта 2015 года.
Диев А.Б., действительный член МОИП.

Конспект лекции:

Микроклональное размножение растений делится на два этапа – непосредственно размножение растительного материала in vitro (проводится в специализированной лаборатории) и последующая адаптация микроскопических растений (может проводиться любым желающим в домашних условиях).

Первый этап представляет из себя, образно говоря, «микрочеренкование» (массовое размножение при помощи «микрочеренков»). У растения срезают тонкий (0,8 мм) слой с верхушки почки, который содержит клетки верхушечной меристемы. Этот материал помещают на стерильную питательную среду на основе агара (среда в обязательном порядке содержит сахара, питательные элементы, а также в среды на разных этапах микроразмножения могут добавлять фитогормоны). Растительные клетки активно делятся, на питательной среде начинает формироваться маленькое растение – и через некоторое время у него снова срезают верхушечную меристему и переносят на новую питательную среду. Такие пересевы («пассажи») производят несколько раз, в результате растительные клетки адаптируют к развитию на искусственных питательных средах и одновременно снижается вероятность завирусованности растительного материала. Считается, что клетки апикальных меристем свободны от вирусов вследствие своих свойств свойств (т.к. распространение вирусов имеет свою скорость, даже в заражённом растении вирусы «не успевают» проникнуть в активно делящиеся меристематические клетки). В качестве дополнительных процедур возможны химические обработки от вирусов, но они всё-таки действуют на растительные ткани угнетающе.

Запускаемое в массовое размножение микроклональное растение должно быть свободно от вирусов, поэтому его проверяют молекулярно-генетическими методами на отсутствие заражённости. Тест на один вирус стоит порядка 500-700 рублей, набор проверяемых вирусов различен для разных культур. Так, малину тестируют на 5 вирусов. Убедившись в «чистоте» растительного образца, приступают к его массовому размножению. В питательную среду добавляют фитогормон, стимулирующий ветвление. С образующихся многочисленных боковых побегов срезают «микрочеренки» и помещают их на агаровую среду (все операции проводят в стерильных условиях, используя ламинарные шкафы). Технология массовая – за одну рабочую смену оператор делает до 800 микрочеренков. Далее – изменяют состав питательной среды, и меристемные растения начинают образовывать корни. Растения какое-то время подращивают (они находятся в герметичных баночках, на стеллажах с круглосуточным освещением). На этой стадии меристемные растения можно поместить на хранение в холодильник на несколько месяцев. Для некоторых культур это даже является положительным моментом – например, для микроклональной сирени, которая после этого лучше развивается и идёт в рост.

Читать еще:  Спатифиллум не цветет почему

Компания «Микроклон» осуществляет поставки размноженных культур в герметичных пластиковых коробочках по 20 штук растений размером несколько сантиметров, находящихся на питательном агарозном геле. Такие приобретенные микроклональные растения в коробочке можно держать до 10 дней (это крайний срок), оптимально 3-7 дней.

Для дальнейшего выращивания меристемных растений необходима процедура адаптации, во время которой должны произойти фундаментальные физиологические перестройки. Меристемные растения надо «приучить» к «растительному» образу жизни и перестроить весь их обмен веществ. Размноженные микроклонально растения привыкли не фотосинтезировать, а получать углеводы из питательной среды (фотосинтез невозможен при всём желании, т.к. меристемные растения находятся в замкнутом объёме без доступа строительного сырья – углекислого газа из окружающей среды). Корни у меристемных растений толстые, похожие на спички, и не имеют всасывающих волосков. Ввиду 100%-ной влажности среды, на листьях полностью открыты устьица, а листовые пластинки не имеют воскового слоя.

Несмотря на всю фундаментальность поставленных задач, инструментально это достигается очень просто – растения помещают в условия со стабильной температурой (без сквозняков!), достаточным освещением (для фотосинтеза) и постепенно уменьшают влажность среды. Для начала полученные меристемные растения пересаживают. Растения берут пинцетом и осторожно и тщательно отмывают корни водой комнатной температуры от агара (А.Д. заранее ставит несколько кювет с водой и последовательно промывает в них корни). Это необходимо, т.к. иначе агар будет служить замечательной питательной средой для патогенных микроорганизмов. Если при отмывке случайно отломили корешок – не беда (т.к. он всё равно практически не функционален), растение отрастит новый, просто срок адаптации увеличится на 2-3 дня. Высадку проводят в кассеты, в торфяные таблетки диаметром 33 мм или кокосовые диаметром 30 мм. Кассеты ставят на стеллаж с освещением. Специальных процедур предпосадочной стерилизации стеллажей А.Д. за три года пока не применял, т.е. «проблема стерилизации на этом этапе не стоит» (если что, можно применять методы по аналогии с теплицами). Стеллаж накрывают полиэтиленовой плёнкой (100% влажность), потом плёнку начинают чуть приоткрывать на некоторое время, затем открывают всё больше и больше, и наконец снимают совсем. Весь процесс адаптации занимает максимум 4 недели, в среднем 2-3. Самые ответственные и сложные – первые дни адаптации. Лучше приживаются породы, которые ближе к древесным – сирень, алыча и пр., более ранимы породы ближе к травянистым, например, актинидия, при промывке стараться не намочить листья. Эта разница в адаптации в первые 2-3 дня, потом все растения нормально развиваются, если «зацепились».

Полив под корень не применяют. Под кассеты подкладывают капиллярный мат (самодельный: сложенный втрое нетканый материал, накрытый сверху цельным, т.е в 2 слоя ткани, «синтетическим» мешком из-под сахара), который увлажняют не чаще одного раза в сутки – влага из него через отверстия в кассете поступает к растениям. Также периодически опрыскивают растения, в том числе растворами комплексных удобрений в качестве подкормки. Подкормки комплексными удобрениями по листьям можно начинать с четвёртого дня адаптации, концентрацию берут поменьше, но обрабатывают почаще (1, затем 2 раза в неделю). При дальнейшем доращивании растений развитие корневой системы достигается перевалкой, проводимой несколько раз во всё большие по объёму горшки. Есть пока не решённая проблема с тем, что корни через отверстия в горшках проникают в капиллярный мат. В горшках также неравномерно развивается корневая система (закручивается по внутренней поверхности горшка), даже при периодической перевалке. Очень хороши горшки AirPot, но они довольно дорогие, для массового производства их использование слишком накладно.

В сотрудничестве с Компанией «Микроклон» А.Д. массово размножает довольно много декоративных культур, из плодово-ягодных – землянику, малину, ежевику, виноград, один сорт крыжовника, приступили к вопросу микроклонального размножения 2 сортов яблони, есть планы по абрикосу. По личным наблюдениям А.Д., увеличения урожайности у микроклонально размноженных ягодных культур не наблюдается (т.е. она не превышает максимальную для сорта). Однако есть очень много других плюсов. Меристемное растение как бы «обнуляет счётчик», биологически оно является ювенильным, поэтому растёт и развивается очень энергично, но в то же время ведёт себя как взрослое. Так, ремонтантные сорта малины, поставленные на адаптацию микроскопическими растениями в январе – в сентябре уже с плодами. У ежевики за аналогичные сроки плеть вырастает до 1,2 м. К достоинствам технологии относится также то, что при отработанной методике можно быстро и практически в неограниченных количествах размножить ценное растение, возникший новый клон и т.д. Полученные по технологии in vitro растения впоследствии легче размножаются зелёными черенками, т.е. лучше укореняются (из личного опыта А.Д.). Микроклональное размножение позволяет питомниководам продуктивно использовать зимний период.

Не все культуры успешно размножаются микрочеренкованием, но их круг всё равно шире, чем культур, хорошо размножаемых обычным зелёным черенкованием. Проблемы возникают, в частности, с культурами, которые сильно «фенолят» – выделяют корнями в субстрат фенольные соединения, что приводит к отравлению самих меристемных растений, находящихся в замкнутой системе. Очень тяжело вводить в меристемную культуру хвойные, орехоплодные, луковичные. В целом для каждой культуры надо подбирать свои особенности технологии, что может потребовать разного количества времени и усилий. Также приходится подбирать свои условия и для микроклонального размножения разных сортов в рамках одной культуры. Поэтому сортимент введённых в меристемную культуру плодово-ягодных растений пока не очень велик.

К микроклональному размножению часто высказывают упрёк, что оно приводит к мутациям у получаемых растений. Соматические мутации возможны (из-за повышенного гормонального фона), но реально они возникают не так часто, более того, в «Микроклоне» такие мутанты стараются выявлять и оставляют себе для исследований (на предмет получения более хозяйственно-ценных клонов). Действительно реальная проблема есть с сортами, которые являются химерами (например, сорт сирени «Сенсация»). В результате их размножения in vitro действительно часто наблюдается расхимеривание у части растений. Но это максимум 10%, при этом нормальные фирмы для таких случаев специально увеличивают поставляемую заказчику партию меристемных растений (скажем, при заказе на 100 штук выращивают 105).

В целом А.Д. эта технология очень нравится, в планах расширение набора выращиваемых меристемных культур и сортов и продолжение наблюдений. В частности, пока открыт вопрос, не изменяется ли скороплодность плодовых культур при микроклональном размножении. Также интересно посмотреть, будет ли влиять выращивание деревьев на своих корнях на вкусовые качества плодов (в трудах Бербанка и Мичурина есть сведения о положительном влиянии корнесобственности).

Комнатные плодовые экзоты

Микроклональное размножение цитрусовых

1C_Nik 17 фев 2019

Вопрос к уважаемым цитрусоводам: кто-нибудь занимался подобным размножением цитрусовых?

— возможность получения не зараженных саженцев

— быстрое размножение особо ценных и/или трудно размножаемых растений

— ускорение селекции путем отбора мутантных форм in vitro

— трудно воспроизводимая в домашних условиях технология

— недешевые реактивы и оборудование

— необходимы базовые знания химии, биологии и навыки лабораторной работы

Далее приведу некоторые источники по теме.

по ссылке ниже автореферат на соискание КБН Самариной Л.С., по теме: «ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИЕМОВ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ И СОХРАНЕНИЯ ЛИМОНА IN VITRO»

1C_Nik 17 фев 2019

1C_Nik 17 фев 2019

Нашел так-же группу энтузиастов в ВК:

Имея ясный ум и твёрдую память, мне захотелось заняться меристемным размножением растений (микроклонирование, клональное микроразмножение). Беглый анализ показал, что никакого заоблачного оборудования или других специальных условий для меристемного размножения в домашней лаборатории не требуется. В этой группе будет собираться информация, найденная в сети по данной теме, а также будет отображён ход моей работы. Милости прошу вступать в группу всех неравнодушных и вносить свой вклад в тему «клонирование на коленке».

Сообщение отредактировал 1C_Nik: 17 Февраль 2019 — 20:57

Nyima 17 фев 2019

Павел, у нас не принято копировать объемные тексты из интернета. Копируются при необходимости только небольшие выдержки. А вот прямую ссылку на источник давать не запрещено (с собственным сопроводительным словом).

Вот этот текст откуда? При цитировании ссылка обязательна.

1C_Nik 17 фев 2019

Понял, объемный сейчас обрежу, ссылку на источник уже указал.

cactus 17 фев 2019

НЕТ! Ничего не обрезайте — у нас всё источники заблокированы.

Я могу читать и смотреть только здесь.

Сообщение отредактировал cactus: 17 Февраль 2019 — 21:19

1C_Nik 17 фев 2019

Вебинар «Современные технологии получения посадочного материала методом клонального микроразмножения»

1C_Nik 17 фев 2019

НЕТ! Ничего не обрезайте — у нас всё источники заблокированы.

Я могу читать и смотреть только здесь.

Пришлите в личку Ваш e-mail, я вам текст туда скину.

1C_Nik 17 фев 2019

статья противницы микроклонального размножения, в которой ставится под сомнение генетическая идентичность микроклонов. Оно и логично, при дезинфекции в клетках экспланта могут происходить мутации, и клон может отличаться от исходного растения. Но по мне, это может быть даже интересно для селекции растений путем микроклонального размножения.

akr74 17 фев 2019

1C_Nik 17 фев 2019

В том то и преимущество микроклонального размножения — что не нужны огромные площади для размножения субтропические условия создать в лаборатории вполне под силу.

Рядовой цитрусовод может иметь соответствующую специальность и иметь доступ к лабораторному оборудованию и реактивам на работе.

Одно из преимуществ культуры тканей in vitro — ускорение прохождения ювенильной фазы растений. В селекции цитрусовых это просто булыжник преткновения. Не хватает жизни для выведения перспективных сортов.

Sveta-waw 17 фев 2019

Павел, а Вы что закончили, чтобы заниматься биотехнологией и генной инженерией в домашних условиях?

1C_Nik 17 фев 2019

Павел, а Вы что закончили, чтобы заниматься биотехнологией и генной инженерией в домашних условиях?

В тканевой культуре и микроклонировании в чистом виде, генная инженерия — побочный эффект. Примерно на уровне прививки мутировавшей почки.

Специализированного образования именно по биотехнологии и генной инженерии, равно как по химии не имею, но умение получать и применять знания имеется.

Ничего высоко-технологичного в микроклонировании растений нет, залог успеха — стерильность, правильно приготовленные питательные среды и гормоны вегетативного роста и корнеобразования.

Ну и, естественно, навыки работы в лаборатории должны быть (аккуратность, точность расчетов при приготовлении сред, соблюдение стерильности)

Читать еще:  Цветок алоэ вера лечебные свойства и как за ним ухаживать

Sveta-waw 17 фев 2019

Специализированного образования именно по биотехнологии и генной инженерии, равно как по химии не имею, но умение получать и применять знания имеется.

Что-ж, это замечательно.

Но когда ты учишься по этой специальности 5,5 лет, а потом работаешь по этой специальности 3 года, то становишься скептиком.

1C_Nik 17 фев 2019

. Но когда ты учишься по этой специальности 5,5 лет, а потом работаешь по этой специальности 3 года, то становишься скептиком.

У Вас профильное образование и опыт работы с тканевыми культурами? Расскажите что именно привело к тому, что Вы относитесь к тканевым культурам со скепсисом?

Или Вы со скепсисом относитесь к возможности работы с тканевыми культурами в домашних условиях?

cactus 17 фев 2019

Вот, как хорошо!
Светлана, развейте мои сомнения/подозрения: правда ли, что растения полученные таким образом не долговечны?

1C_Nik 17 фев 2019

Вот, как хорошо!
Светлана, развейте мои сомнения/подозрения: правда ли, что растения полученные таким образом не долговечны?

Я хоть и не Светлана, могу ответить на Ваш вопрос. В случае если при размножении микроклонированием не произошла мутация группы клеток, то полученное таким способом растение по долговечности будет идентично растению, полученному любым другим вегетативным способом (укоренение черенка, присыпка, воздушная отводка).

Маринамуха 17 фев 2019

Э-э-э. прошу прощения, что есть присыпка?

1C_Nik 17 фев 2019

Э-э-э. прошу прощения, что есть присыпка?

Видимо мой местечковый сленг, с детства так отводки путем пригибания ветви к грунту, пришпиливания рогатиной и присыпки грунтом называю.

1C_Nik 18 фев 2019

В нашем ПГНИУ пробуют заниматься микроклональным размножением цитрусов. Материал берут из коллекции ботсада. Я там принимаю активное участие в создании и обновлении коллекции. Иногда, по приглашению, учавствую в мастерклассах по прививкам.
Основа коллекции — переданная мной несколько лет назад часть моей домашней коллекции. Вроде на кафедре физиологии растений биофака даже вышла статья о микроклональном размножении цитрусов. Можно поискать в инете.

о клонировании растений по-простому

Клонирование растений — о меристемном размножении растений (микроклонировании) простым и доступным языком

В последнее время садоводам и огородникам все чаще приходится встречаться с терминами «меристемные растения», «растения из пробирки», «микроклоноривание» и т.п.

Многие не только не понимают значение подобных терминов, но и боятся приобретать растения и посадочный материал, полученный подобными способами, хотя их опасения часто беспочвенны.

Сразу хотелось бы отметить, что речь в данной статье пойдет исключительно о растениях и все описанные методы применимы только к растительному миру!

Что же такое клонирование растений?

Известно 2 способа размножения растений – семенной и вегетативный (черенками, прививками, отводками и т.д.). Семенной способ размножения обеспечивает биологическое разнообразие за счет случайной комбинации генов, а вегетативный позволяет сохранить и передать индивидуальные особенности размножаемого растения и получить точную генетическую копию, т.е. клон.

Практически каждый человек, даже не задумываясь над тем, что делает, хотя бы раз в жизни занимался клонированием растений, когда размножал листовым черенком фиалку, стеблевыми черенками или отводками смородину, розы и многие другие культуры. Чтобы сохранить все качества сорта человек размножает растения вегетативно, получая все новые генетические копии материнского растения. Многочисленные копии растений одно и того же сорта растут в садах в различных уголках страны.

Но количество растений, которое можно получить, например черенкованием или прививкой ограничено несколькими десятками или сотнями экземпляров. В то же время, чтобы удовлетворить потребности сельского хозяйства и получить в сжатые сроки большое количество растений определенного сорта или быстро размножить новый гибрид прибегают к современным методам, таким как микроклонирование растений. Проще говоря, микроклонирование – это то же вегетативное размножение, но на микроуровне в условиях лаборатории.

В качестве исходного материала для размножения могут использоваться меристемы, кусочки ткани взрослого растения или незрелые зародыши, полученные из семян. Но зачастую именно меристемы являются исходным материалом для микроклонирования.

Как получают меристемные растения?

Меристема происходит от греческого слова meristos — делимый. Меристемы растений сохраняют способность к делению, обеспечивают рост растения, дают начало новым клеткам и тканям, помогают в заживлении ран.

Существует несколько видов меристем, но для размножения in vitro (в пробирке) чаще всего используют верхушечные (апикальные) или боковые меристемы.

Меристема извлекается из растения в стерильных условиях и помещается в пробирку с питательной средой, которая содержит все необходимые микро-, макроэлементы и витамины, необходимые для роста растения. Клетки апикальной меристемы делятся, формируя побег.

Впоследствии полученный побег можно снова разделить на несколько частей, так чтобы каждая часть несла меристему, способную сформировать новый побег. Подобный цикл может продолжаться до бесконечности или пока не будет получено необходимое количество побегов. Теоретически из одной почки за год можно получить несколько десятков миллионов клонов, что невозможно при классических способах вегетативного размножения.

Полученные побеги помещают на специальную среду, чтобы стимулировать образование корней. Укорененные растения высаживают из пробирки в торфотаблетки или горшочки с почвосмесью и адаптируют к условиям открытого грунта в специальных гринхаузах, где поддерживается очень высокая влажность воздуха благодаря туманообразующим установкам.

Через несколько месяцев молодое растение может быть высажено в открытый грунт или в тепличку.

Видео: Клонирование (микроклонирование) растений

Преимущества и недостатки меристемных растений

Одно из главных преимуществ данного метода размножения – это возможность получить здоровое растение, которое будет полностью соответствовать сорту. При размножении растений черенками или прививками от материнского растения берется слишком большой фрагмент, который несет в себе не только характеристики сорта, но и болезни, которыми возможно заражено растений. При меристемной культуре берется микроскопический фрагмент активно делящихся клеток, которые зачастую делятся гораздо быстрее, чем успевают поражаться инфекцией (вирусами, бактериями и т.д.). Эту особенность используют для сохранения наиболее ценных сортов, очистки от инфекций и последующего размножения. Именно с помощью данных методов были очищены от вирусов и размножены многочисленные сорта плодовых (черешня, яблоня), ягодных (земляника) и овощных культур.

Также к достоинствам метода следует отнести возможность получить за сравнительно короткий срок практически неограниченное число растений заданного сорта. Теоретически из одной почки можно за один год получить миллионы растений, что вполне может удовлетворить все потребность сельского хозяйства и других отраслей.

К недостаткам следует отнести недоступность данного метода для обычных садоводов и огородников, а также сложность адаптации меристемных растений вне специальных условий. Миниатюрные растения в пробирках или в колбах все чаще можно встретить в продаже на выставках и некоторые энтузиасты решаются на покупку. Многих постигает разочарование, поскольку они не в состоянии обеспечить растениям необходимые условия для адаптации, а свои неудачи ошибочно списывают на «слабость» и «нежность» клонированных растений. В то же время, если правильно провести адаптацию меристемных растений, можно получить здоровый элитный посадочный материал.

Каковы главные основы микроразмножения комнатных растений?

Технику микроразмножения можно практиковать в домашних условиях. Многие растения можно размножить только путём микроразмножения. Так же этот метод хорош для выведения новых разновидностей растений.

Микроразмножение- это методика размножения растений в лабораторных условиях или в искусственно созданных условиях. Для микроразмножения берутся побегообразные участки растений ( кончики корней, основания молодых листьев, боковые почки) , отделяют от основного растения и помещают в питательную среду в специальный контейнер или пробирку, где они продолжают своё развитие.

У такого размножения множество положительных моментов.Особенно такой вид рекомендован для растений, зараженных вирусом. Учёными было обнаружено, что на верхушках корней образовательные ткани растения не повреждаются вирусом. Размножение растения таким способом позволяет получить абсолютно здоровое растение от зараженного.

Микроразмножение позволяет размножить те виды и разновидности растений, которые не дают семян и которые поэтому невозможно скрестить с другим видом.

Микроразмножение в домашних условиях.

Необходимые предметы.

Для него можно использовать аквариум достаточного размер. Рядом должна находится лампа дневного света ( 1000-1500 лк), дополнительная система обогрева ( температура окружающей среды должна быть 20-25 градусов), система аэрации, для которой хорошо подойдет электровентилятор.

Стерилизатор необходим для стерилизации предметов, которыми будет производиться срезка посевного материала и стерилизации субстрата и посадочных контейнеров. Дезинфицирующий отбеливатель ( гипохлорид натрия) разводится в дистиллированной воде до 5 % концентрации и используется для стерилизации рабочей поверхности, после её дезинфекции поверхность промывается дистиллированной водой. 1-2 % раствор гипохлорита натрия нужен для стерилизации микрочеренков. Все работы проводятся в медицинских перчатках.

Для срезки микрочеренков используют безопасные бритвы. Черенки складываются в специально подготовленные емкости с широким горлышком.

Субстратом для размножения обычно служит агар-агар. К агар-агару добавляют гормоны и удобрения. Готовые среды для микроразмножения можно найти в аптеках. Полученные растеньица высаживают в торфяной субстрат с нейтральной pH средой. Используют фитогормоны двух типов , для стимуляции роста и пролиферации побегов.

Начало процесса микроразмножения.

Для начала подготовить аквариум или шкаф. оснастить его освещением, отоплением, вентиляцией.

Подготовить питательную среду, обогатив её фитогормонами, наполняют этой смесью колбы или контейнеры. После этой процедуры лезвия и баночки отправляют на стерилизацию в стерилизатор, процедура стерилизации проходит в течении 20 минут при температуре 110-120 градусов. В это время идет подготовка рабочего стола, то есть его промывка 5 % раствором гипохлорита натрия.

Очередной этап- взять самую верхнюю часть растения, которая будет выращиваться (самый легкий для начинающих экземпляр для микроразмножения- сенполия), удаляют с верхушки самые мелкие листочки. Перед помещением очищенной части растения в сосуд, её дезинфицируют 2 % раствором гипохлорита натрия, и промывают дистиллированной водой. Емкость закрывают и ставят в шкаф, где она выдерживается в течении 20-40 дней, с четырнадцатичасовым освещением.

Следующий этап микроразмножения.

Когда микрочеренок, похожий на зелёный сгусток с горошину, с образовавшимися зачатками органов, подготавливают субстрат для укоренения и новые емкости, стерилизуют в стерилизаторе вместе с режущими инструментами. Рабочую поверхность простерилизовать так же, как и на первом этапе. Теперь можно достать растеньице из шкафа или закрытого аквариума, разделить его стерильным лезвием на части. Эти частички нового растения помещают в новые емкости и вновь отправляют в шкаф дней на 20-30 для образования корневой системы. Световой день так же составляет 14 часов.

Последний этап.

Когда образуются корни, растение достают из сосудов для микроразмножения и сажают в горшки , наполненный торфом с нейтральной средой. Затем эти горшочки помещают в специальные пластиковые трубы, чтобы новым растениям можно было постепенно привыкнуть к окружающей среде. После адаптации, которая длится 4-6 недель можно уже выращивать эти новые растения обычным способом, который присущ тому растению, от которого вы взяли материал для микроразмножения. Наиболее подходящие растения для микроразмножения: орхидеи, хризантемы, сенполии, бегонии, азалии, рододендроны, камелии, фикусовые и марантовые.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector